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高效液相色谱常见问题 高效液相色谱柱的选择

时间: 2017-04-10| 浏览次数:558

高效液相色谱柱的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。反相色谱系统使用非极性填充剂,以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用,辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶(如氰基键合硅烷和氨基键合硅烷等)也有使用。正相色谱系统使用极性填充剂,常用的填充剂有硅胶等。

 

高效液相色谱是一种常见的具有高灵敏度、高选择性的高效快速分离、分析技术。它既可以用于微量组分的分析测定,又能用于大量的制备分离,灵活多样。色谱柱的柱效和保护柱,拿到一根新柱时,一定要先看其使说明,然后测柱效,定期检测柱效, 保留在新色谱柱上得到的色谱图,并记录条件, 定期检测仪器的谱带展宽。

 

色谱柱的清洗,对所做的样品要有充分的了解,用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗,对于硅胶柱,先用甲醇洗去极性杂质,然后用干燥的二氯甲烷和正庚烷 1 0 0 — 2 0 O r aL依次活化,对于键和相柱,一般用甲醇一氯仿一甲醇一水依次冲洗,每种色谱柱有特定的清洗方法,一定要看其使用说明。

 

色谱柱的存放,存放前除去杂质和盐,采用合适的存放溶剂,避免色谱柱床的干枯,避免机械振动,防止细菌生长,注意存放的温度。

 

一、高效液相色谱柱的选择

 

目前在高效液相色谱中,分离效果好坏的一个重要指针是色谱填料的正确选择,主要涉及到以下几种填料:硅胶基质填料、聚合物填料、其它无机填料,详情如下。

 

1、正相色谱正相色谱用的固定相通常为硅胶(Silica)以及其它具有极性官能团,如胺基和氰基的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基或其它极性基团极 性较强,因此,分离的次序是依据样品中各组分的极性大小,即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低,如正己烷,氯 仿,二氯甲烷等,高效液相色谱柱的选择。

 

2、反向色谱反向色谱用的填料常是以硅胶为基质,表面键合有极性相对较弱官能团的键合相。反向色谱所使用的流动 相极性较强,通常为水、缓冲液与甲醇、乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被冲洗出,而极性较弱的组分在色谱柱上有更强的保留。常 用的反向填料有C18、C8、C4等。

 

聚合物填料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂等,其重要优点是在PH值为1-14均可使用。相对于硅胶基质的C18填料,这类填料具有更强的疏水性;大孔的聚合物对蛋白质等样品的分离非常有效。现有的聚合特填料的缺点是相对硅胶基质填料,色谱柱柱效较低,高效液相色谱柱的选择。

 

其它HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化,由于其特殊的性质,一般仅限于特殊的用途。如石墨化碳黑正逐渐成为反向色谱柱填料。这种填料的分离不同于硅 胶基质烷基键合相,石墨化碳的表面即是保留的基础,不再需其它的表面改性。该柱填料一般比烷基键合相硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强。石墨化碳可用于 分离某些几何异构体,由于在HPLC流动相中不会被溶解,这类柱可在任何PH与温度下使用。氧化铝也可以用于HPLC。氧化铝微粒刚性强,可制成稳定的色 谱柱柱床,其优点是可以在PH高达12的流动相中使用。

 

但由于氧化铝与碱性化合物的作用也很强,应用范围受到一定限制,所以未能广泛应用。新型色谱氧化锆 基质填料也可用于HPLC。商品化的只有聚全物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱,应用PH1-14,温度可达100℃。由于氧化锆填料是最近几年才开始研究, 加之面临的实验难度,其重要用途与优势尚在进行之中,高效液相色谱柱的选择。

 

目前,商品化的色谱填料粒度从1um到超过30um均有销售,而目前分析分 离主要用3和5um填料。填料的粒度主要影响填充柱的两个参数,即柱效和背压。粒度越小,柱压越大,柱压的增加限制了粒度小于3um的填料应用。在相同选 择性条件下,提高柱效可提高分离度,但不是唯一的因素。如果固定相选择是正确,但是分离度不够,那么选择用更小的粒度的填料是很有用的。3um填料填充柱 的柱效比相同条件下的5um填料的柱效提高近30%;然而,3um的色谱柱的背压却是5um的2倍。

 

高效液相色谱柱的选择,与此同时,柱效提高意味着在相同条件下可以选用更短的 色谱柱,即相同的塔板数或分离能力,但是柱长更短,以缩短分析时间。另外,可以彩用低粘度的溶剂做流动相或增加色谱柱的使用温度,比如用乙腈代替甲醇,以降低色谱柱的压力。

 

二、高效液相色谱常见问题,一般会出现哪些故障

 

主要就是由气泡,无机盐,不溶性物质或者微生物进入仪器引起的仪器堵塞和污染。也可能是配件磨损导致的漏液。大致有6点:

 

1.泵前的单向阀堵塞,不泵液,或者流速不稳定;

2.柱塞杆的密封圈磨损导致漏液;

3.混合池或者泵头污染,导致的压力高,或者不泵液;气泡进入导致压力上下波动;

4.进样针堵塞,或者被污染,或者六通阀漏液;

5.色谱柱被堵住导致压力高;

6.检测器被污染导致压力高或者出现诡峰。

 

高效液相色谱(HPLC:High Performance Liquid Chromatography)是化学、生物化学与分子生物学、医药学、农业、环保、商检、药检、法检等学科领域与专业最为重要的分离分析技术,是分析化学家、生物化学家等用以解决他们面临的各种实际分离分析课题必不可缺少的工具。 了解更多高效色谱产品信息,请关注我们官网或点击在线客服QQ、电话咨询!


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